تئوری و شرح آزمایش:

IMVIC

تستهای این مجموعه شامل بررسی اندول(محصول نهایی متابولیسم وشکسته شدن تریپتوفان)بررسی متابولیسم سیترات وتستهای متیل رد و وگس پروسکوئر می باشد . 

تولید اندول :

برخی ازباکتریها دارای آنزیم تریپتوفاناز هستند ومی توانند درمسیر متابولیسم اسیدآمینه تریپتوفان موجوددر محیط اندول تولید نماییند که بامعرف کواکس یا ارلیش واکنش می دهد .

روش کار

از محیط SIM که حاوی اسیدآمینه تریپتوفان است استفاده می شود .باکتری رابه صورت عمقی درمحیط کشت داده ومحیط فوق رادر دمای37درجه به مدت 24تا48ساعت نگهداری کنید.پس ازآن درحدود 5 دهم میلی لیتر(5قطره)معرف کواکس به آن اضافه نماید درصورتیکه باکتری اندول آزاد کرده باشد حلقه قرمزرنگی درسطح محیط ظاهر خواهد شد مثل E.coli .

نکته :درمحیطی که برای تست آنزیم تریپتوفانازبه کار می رود(SIM)قند گلوکز وجود نداردزیرا مانع از تولید اندول درمحیط می گردد در ضمن دراين محيط حركت وتوليد H2S نيز مشاهده مي شود.

تست Methyl Red :

برخی ازباکترها قادر به تخمیر مخلوط اسیدی (Mixed acid fermentation)هستندواز تخمیر گلوکز تولید اسید می کنند اسید حاصل توسط معرفی مانند متیل رد مشخص می شود .

روش کار: باکتری را در محیط MR-VPکشت داده برای مدت 48ساعت در دمای37درجه سانتیگراد نگهداری نمایید . سپس باافزودن چند قطره معرف 4درصد متیل رد درصورت تولید اسید واکنش مثبت خواهد بود که دراین صورت PHمحیط کمتراز4/4بوده ورنگ قرمز ظاهر می شود(مثلE.coli) واکنش منفی بارنگ زرد مشخص می شودکهPHمحیط بیشتراز7خواهد بود .

تست(VP)

محيط MRVP                       تست وزبروسكوير

برخی از باکتریها دارای چرخه تخمیر بوتاندیول (BUtanediol fermentation) می باشند وازتخمیر گلوکز درمرحله نهایی مادهای به نام استیل متیل کربینول (استوئین)تولید می کنند . این ماده درمحیط قلیایی ودرحضوراکسیزن به دی استیل تبدیل می شود .دی استیل ایجاد شده دراثر تاثیر کاتالیتیک آلفا نفتول وکراتین به ترکیب قرمز رنگ تبدیل شده که اساس تستvp راتشکیل می شود .

روش کار :

باکتری رادرمحیط MR-VPکشت داده پس از 4ساعت نگهداری دردمای 37درجه سانتیگراد 6دهم میلی لیتر(6قطره)آلفانفتول وسپس 2دهم میلی لیتر KOHباغلظت 40درصد رابه آن اضافه نماییدوبه خوبی مخلوط کرده وبرای مدت15دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید . ظهور رنگ قرمز درمحیط نشاندهنده حضور استوئین ومثبت بودن VPاست مثل (کلبسیلا) .

معرف VP

تست سیترات :       

باکتریهای که قادرند سیترات رابه عنوان تنها منبع کربن ومنبع انرزی ونمک آمونیوم رابه عنوان تنها منبع ازت جهت رشد خودبه کار  برند قادراند محیط سیمون سیرات که حاوی معرف بروموتیمول آبی(سبزرنگ)است رابه رنگ آبی تبدیل کنند .

روش کار :

باکتری را درمحیط سیمون سیرات که به صورت سطح شیبدار است کشت دهید و در دمای37درجه سانتیگراد به مدت 24ساعت نگهداری کنید درصورتیکه رنگ سبز اولیه به رنگ آبی تبدیل شود واکنش مثبت است(مثل کلبسیلا_ رنگ سبز نشانه منفی بودن واکنش است .)

جواب سوالات مطرح شده در جلسه قبل :

1)      در مورد محیط کشت SIM : این محیط برای بررسی حرکت باکتری و توانایی آن در احیای گوگرد و تولید H2S و تجزیه تریپتوفان (تست ایندول) استفاده می شود که محیطی نیمه جامد با رنگ زرد است.

2)       در مورد محیط MR-VP  : این محیط شامل پپتون-دکستروز و دی پتاسیم فسفات است و برای تشخیص فرآورده حاصل از تجزیه گلوکز استفاده می شود.

نمونه های مورد استفاده در آزمایشگاه : انترو باکتر و E.coli

نتیجه:

محیط سیترات ما آبی رنگ شده است.(سیترات مثبت)

در محیط SIM کل محیط کدر شده است که نشان از متحرک بودن باکتری می باشد.سیاه رنگ نیز نمی باشد پس H2S نیز تولید نکرده است.با اضافه کردن کواکس تغییری(حلقه صورتی) در محیط ایجاد نشد.(اندول منفی)

محیط MRBP را به دوقسمت مساوی تقسیم می کنیم. در یک لوله 6 قطره آلفا نفتول و 4 قطره پتاسیم هید روکسیم می ریزیم اگر رنگ چایی به خود گرفت یعنی VP مثبت می باشد که در آزمایش ما نیز VP مثبت می باشد.(VP مثبت)

و در لوله دیگر 4 قطره متیل رد می ریزیم که اگر محیط زرد ما قرمز شد تست متیل رد ما مثبت       می باشد.در صورت تغییر نکردن MR منفی می باشد.که در آزمایش ما محیط زرد و نارنجی حاکی از اینست که تست MR ما منفی می باشد.(MR منفی)

I         M         V        C

انتروباکتر:                                                                                       +              +               -           -

ایشیرشیا ایکالای:                                                                         _             _               +         +

منابع:

starters.blogfa.com

http://microbes.blogfa.com/ ، http://microbshenasi.blogfa.com/